Молекулярные ритмы жизни. Нобелевская премия

13.11.2017

Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили американские исследователи Джеффри Холл (Jeffrey C.Hall), Майкл Росбаш (Michael Rosbash) и Майкл Янг (Michael W. Young) за открытие молекулярных механизмов, управляющих циркадными ритмами.

Что бывает, когда не выспишься, знает каждый: трудно сосредоточиться, быстро наступает утомление, а настроение стремительно портится по пустякам. Но в то, что регулярный недосып сказывается и на обмене веществ, и на иммунитете, и на работе сердца, верится с трудом. Однако это именно так. Сон — одно из проявлений суточных ритмов, которые влияют на весь организм.

Известно, что днём и ночью у нас разная температура тела, что днём и ночью по-разному работают сердце и сосуды, что обмен веществ подчиняется суточным колебаниям. Понятно, что если вмешиваться в ход биологических часов, то последствия будут довольно серьёзные.

И неплохо бы знать, как устроены эти часы, какая пружина приводит их в действие.

Может показаться, что всё дело в смене дня и ночи. С самого момента появления жизни на Земле живым организмам приходилось как-то адаптироваться к регулярным изменениям освещённости.

Однако ещё в XVIII веке французский астроном Жан-Жак де Меран заметил, что биологические часы обладают определённой автономией. Он экспериментировал с гелиотропами, которые поворачивают соцветия вслед за солнцем и опускают свои листья на ночь. Понаблюдав за растениями, круглые сутки находившимися в темноте, де Меран обнаружил, что они продолжают поднимать и опускать листья.

Впоследствии были и другие эксперименты (подробно о них можно прочитать в статье «Триллион беззвучных часов» — «Наука и жизнь» № 5, 2009 г.), которые окончательно убедили биологов, что у живых организмов есть собственные самостоятельные ритмы. Правда, оказалось, что сами по себе эти ритмы лишь приблизительно совпадают с суточным временем.

Так, внутренние циркадные ритмы растений составляют 23—28 часов, а животных — 23—25 часов (потому их и назвали циркадными или циркадианными — от лат. сirca dies, то есть «около суток»). Чтобы внутренние часы стали 24-часовыми, нужен свет, точнее, регулярная смена освещённости: если вокруг нас день и ночь сменяют друг друга естественным образом, то и часы подстраиваются под них.

У человека и вообще у млекопитающих циркадные ритмы с реальным временем согласовывает особая структура — «супрахиаз-матическое ядро», расположенное в головном мозге, в гипоталамусе. Оно получает сигналы напрямую от глаз и задаёт ритм всем остальным часам во всех органах и тканях, то есть супрахиазматическое ядро можно назвать нашим «главным циферблатом». Но что приводит все эти часы в действие? Очевидно, какие-то особенные гены.

Впервые о часовых генах заговорили в начале 1970-х годов, после экспериментов с дрозофилами, которые выполнили физик и молекулярный биолог Сеймур Бензер и его студент Рональд Конопка, работавшие в то время в Калифорнийском технологическом институте. Они вносили в ДНК дрозофил мутации и следили, меняется ли суточный ритм у мух. В результате Бензеру и Конопке удалось получить три разновидности мух, у которых и поведение, и даже время выхода взрослого насекомого из куколки не соответствовали обычному суточному расписанию: у одних мух внутренние часы пошли быстрее и цикл стал 19-часовым, у других, наоборот, замедлились, так что их сутки удлинились до 28 часов; наконец, мутанты третьей разновидности вообще утратили какой-либо ритм.

Скрещивая мутантов между собой, Бензер и Конопка установили, что все мутации относятся к одному и тому же гену, который впоследствии получил название period или per. Они предположили, что у мутантов, утративших ритм, ген совсем не действует, а у тех, у кого внутренние часы стали идти быстрее или медленнее, ген работает, но его активность не такая, какая должна быть в норме. Эксперименты Бензера и Конопки, безусловно, стоило бы отметить Нобелевской премией, но, к сожалению, сейчас это уже невозможно: Сеймур Бензер умер в 2007 году, Рональд Конопка — в 2015-м.

Что именно представляет собой ген "per" и какой белок кодирует, стало понятно в середине 1980-х годов, когда "per" удалось вырезать из ДНК и определить нуклеотидную последовательность. Это сделали нынешние нобелевские лауреаты — Джеффри Холл и Майкл Росбаш, работавшие тогда в Брандейском университете, и Майкл Янг из Рокфеллеровского университета.

Теперь, получив ген в руки, можно было подумать о том, что за молекулярный механизм с ним связан.

Поскольку речь идёт о периодических изменениях в поведении и физиологии, то очевидно, что ген должен быть чем-то вроде осциллятора.

Объяснить, как он работает, оказалось непросто. В одной из моделей предполагалось, что ген per (точнее, белок, который он кодирует) создаёт градиент на клеточной мембране; иными словами, работает как насос, который перекачивает некое вещество, и по одну сторону мембраны вещества становится всё больше, а по другую — всё меньше. Согласно градиентной модели, разница в концентрациях в какой-то момент достигала бы порога, после чего открывались бы другие каналы и вещество начинало бы двигаться в обратном направлении. Также считалось, что эти другие каналы реагируют на свет, так что в целом модель вполне удачно описывала и ритмические изменения (колебания градиента концентрации), и связь ритма со сменой дня и ночи.

Однако когда Холл, Росбаш и Янг в конце концов расшифровали механизм работы гена "per", он оказался другим и в каком-то смысле более простым.

Но чтобы понять его, нужно вспомнить, как вообще реализуется генетическая информация.

Ген — это кусок ДНК, в котором на языке генетического кода записана структура того или иного белка. Но прямо на ДНК белок собрать нельзя.

Поэтому сначала появляется копия гена в виде другой нуклеиновой кислоты — матричной РНК (мРНК). Синтез РНК называется транскрипцией и происходит в ядре, после чего РНК проходит ещё через несколько молекулярных реакций и выходит из ядра в цитоплазму. Здесь на неё садятся белоксинтезирующие машины — рибосомы и начинается трансляция, то есть сборка белковых молекул. Количество белка, которое получается в итоге, зависит и от количества мРНК-копий (то есть от интенсивности транскрипции), и от активности рибосом (то есть от интенсивности трансляции). Кроме того, не будем забывать: в клетке всё время работают ферменты, расщепляющие белки, так что уровень того или иного белка будет также зависеть от активности таких ферментов.

Сначала Холл и Росбаш заметили, что уровень белка PER в нейронах мозга дрозофилы колеблется: больше всего белка в них ночью, а днём его уровень падает. Более того, такие же изменения происходили и с РНК белка "PER", однако тут была одна особенность. Максимумы матричной РНК белка PER и самого белка не совпадали — сначала на пик поднималась РНК, потом её уровень начинал падать, но уровень белка в это время продолжал расти и достигал максимума через несколько часов.

У мух-мутантов, утративших суточный ритм, никаких периодических изменений в молекулах РНК и белка PER не было, однако, если в мутантные клетки вводили нормальный, немутантный белок, суточные колебания РНК возвращались.

Всё выглядело так, что белок PER сам регулирует активность собственного гена по механизму отрицательной обратной связи: чем больше белка, тем менее активен его ген. В конце концов, нового белка в клетке уже почти не синтезируется, между тем его продолжают расщеплять ферменты, так что его количество начинает падать — ровно до того момента, пока он не «освободит» свой ген.

Дальнейшие эксперименты показали, что белок PER регулярно появляется в ядре, но путешествует в ядро он не один. В начале 1990-х годов, пока Холл и Росбаш занимались белком PER, Майкл Янг обнаружил, что есть ещё один ген, который влияет на суточные ритмы. Ген получил название timeless, а его белок TIM, как оказалось, способен связываться с белком PER, провожая его в ядро и одновременно защищая его от деградации ферментами-разрушителями. Мутации в гене timeless сбивали суточные колебания белка PER точно так же, как мутации в гене per отменяли суточные колебания белка TIM. Что именно PER и TIM делают с ДНК собственных генов, в то время было не совсем понятно. Однако сама модель транскрипционно-трансляционной обратной связи как главной пружины внутренних часов казалась наиболее достоверным объяснением, и дальнейшие эксперименты это только подтвердили.

Майкл Янг открыл ещё один важный белок — DBT, кодируемый геном doubletime. В биологических часах он играет роль корректора хода. Дело в том, что и транскрипция (синтез РНК) и трансляция (синтез белка) происходят очень быстро, и для того, чтобы растянуть накопление и распад белка до 24-часового периода, в клетках существует довольно сложный механизм, состоящий из нескольких регуляторных белков. Эти регуляторные белки меняют активность основных «часовых» белков, управляют их сборкой в рабочие комплексы и регулируют скорость их разрушения — всё для того, чтобы белки PER и TIM накапливались и исчезали с правильной скоростью и отправлялись в ядро именно тогда, когда нужно. DBT в системе поправки хода — один из главных игроков: он модифицирует молекулы PER таким образом, что они начинают очень быстро распадаться, и накапливается он поэтому довольно медленно.

Смысл работы Янга был не столько в самом белке DBT, сколько в том, что теперь стало ясно: молекулярная пружина биологических часов снабжена мощной регуляторной системой. Действительно, PER, TIM и DBT — далеко не единственные часовые белки. К концу 1990-х годов биологи нашли ещё два гена, крайне важных для суточных ритмов: clock и cycle. (Слово «clock» означает вовсе не «часы», как можно было бы подумать, — это аббревиатура от circadian locomotor output cycles kaput, что можно с натяжкой перевести как «циркадный прерыватель циклов двигательной активности».) Белки CLK (с гена clock) и CYC (с гена cycle) связываются друг с другом и в таком виде садятся на специальные места в генах per и timeless, активируя тот и другой. В свою очередь TIM и PER, приходя в ядро, взаимодействуют с белком CLK так, что пара CLK-CYC перестаёт стимулировать гены per и timeless, то есть CLK и CYC самым непосредственным образом участвуют в работе биологических часов, хотя для циклических изменений всё равно нужны TIM и PER.

Стоит упомянуть также ген cryptochrome и его белок CRY. Внутренние часы, хотя и обладают определённой автономией, всё же должны ориентироваться на окружающую среду, и белок CRY — один из тех, которые не дают суточным ритмам утратить связь с реальностью. Свет стимулирует синтез CRY, и он усиливает разрушение белка TIM — того самого, который ведёт PER в ядро и защищает его от деградации. То есть днём белка CRY становится всё больше, белков TIM и PER — всё меньше; в конце концов гены timeless и period опять активируются — и цикл начинается снова. Можно сказать, что CRY в прямом смысле связывает внутренние часы со светом.

Чем больше биологи изучали механизм биологических часов, тем больше обнаруживали разных белков, причастных к этому механизму. Самые первые эксперименты на эту тему ставили с дрозофилами, и когда потом суточные ритмы на молекулярном уровне стали изучать на других живых организмах, то у них оказались свои особенности. Например, тот же белок CRY у млекопитающих, по-видимому, может работать в светозависимом и светонезависимом режимах. Сейчас уже известно, что наши глаза напрямую посылают в главные наши часы — супрахиазматическое ядро — сигнал о том, сколько света вокруг нас, но специалисты продолжают спорить, как этот сигнал оформляется на молекулярном уровне в нейронах супрахиазматического ядра и какую роль тут играет CRY (и играет ли вообще).

Однако никто уже не спорит с тем, что сама молекулярная схема внутреннего хронометра работает одинаково во всех клетках почти у всех живых существ и что главной пружиной служат периодические колебания нескольких молекул, управляющих собственным синтезом. И всё же тут есть пара примечательных исключений. Во-первых, у некоторых цианобактерий молекулярный аппарат суточных ритмов вообще никак не связан с ДНК, РНК и изменением количества белков.

У цианобактерий есть три белка, два из них то навешивают, то снимают с третьего остатки фосфорной кислоты. Цикл фосфорилирования-дефосфорилирования происходит по 24-часовому расписанию, и этот третий белок соответственно меняет свою активность в зависимости от того, фосфорилирован он или нет. Во-вторых, в эритроцитах человека суточные колебания происходят с белком пероксиредоксином, чья задача — очищать клетки от опасного пероксида водорода, способного окислить и испортить множество биомолекул. Выяснилось, что активность пероксиредоксина и количество связанного с ним пероксида зависят от времени суток.

При этом в эритроцитах нет ни ядра, ни ДНК, так что пероксиредоксиновые часы работают самостоятельно.

Впрочем, обнаружили их совсем недавно, и пока непонятно, велика ли их роль в физиологии всего организма и как они согласованы с обычными ДНК-РНК белковыми часами.

Мы начали с того, какую огромную роль играют суточные ритмы для нашего здоровья. И раз уж сейчас так много известно про молекулярные пружины биологических часов, можем ли мы объяснить, почему проблемы с суточными ритмами способствуют тем или иным болезням?

Кое-где действительно можем. Так, в прошлом году в журнале «Cell Metabolism» появилась статья с описанием того, как "испорченные часы" увеличивают риск злокачественной опухоли. Дело в том, что белок PER2 (один из семейства белков PER) и белок BMAL1 (ещё один важный «суточный» белок, который работает с белками PER) вместе контролируют работу гена c-myc. Это очень известный ген — он стимулирует клеточное деление, и слишком активный c-myc часто оказывается причиной рака. Белки PER и BMAL1 следят за тем, чтобы c-myc не слишком «активничал», но если с самими PER и BMAL1 что-то случится, то c-myc начнёт работать всё время, с очень вероятными злокачественными последствиями.

Другой пример — совсем свежее исследование сотрудников Гуэлфского университета (Канада), опубликованное в октябре нынешнего года в журнале «Cardiovascular Research».

Им удалось установить, что мутации в гене clock делают сердце более чувствительным к разным заболеваниям, а всё из-за того, что в сердечной мышце нарушается энергетический обмен. Попутно выяснилось, что женские половые гормоны позволяют смягчить вредный эффект от испорченных часов, то есть можно понять, почему женское сердце в среднем крепче мужского и почему женщины сталкиваются с заболеваниями сердца в среднем позже мужчин.

Есть также масса исследований, посвящённых взаимосвязи обмена веществ и суточных ритмов. Основной их вывод состоит в том, что сбитые биологические часы повышают вероятность метаболических расстройств, ожирения и диабета. А испортиться суточные ритмы могут и без всяких мутаций — достаточно ложиться спать в разное время, устраивать себе бессонные ночи перед компьютером или просто регулярно пересекать несколько часовых поясов.

Биологические часы не в силах отключить наше сознание и насильно отправить в сон, поэтому, пока мы бодрствуем при искусственном свете, они продолжают поддерживать активность генов на дневном уровне, и в результате расписание молекулярно-клеточной активности выбивается из графика, приводя к разнообразным неприятным последствиям.

Правда, стоит уточнить, что мы далеко не всегда в деталях знаем, как именно часовой механизм влияет на тот или иной физиологический процесс. Например, известно, что сигналы из супрахиазматического ядра (напомним — эта зона в мозге считается у млекопитающих «главным часовым» механизмом) разбегаются по телу по периферическим нервам и с помощью гормонов, а местные часы, которые принадлежат печени, почкам, сердцу, мышцам и т. д., подстраивают свою активность под сигнал из центра; в результате у нас меняется уровень инсулина и других гормонов, повышается или снижается температура тела, кровяное давление и т. д. Но в конкретных молекулярных мостиках, которые связывают центральные часы с местными, а местные часы — с той или иной специфической молекулой, часто не хватает одного или нескольких звеньев: их просто пока ещё не открыли.

Много интересного ещё предстоит узнать про взаимоотношения часов разных уровней друг с другом. Например, сейчас всё чаще говорят о том, что не только супрахиазматическое ядро в мозге сообщает «низшим» часам, какое сейчас время суток и что нужно делать, но и наоборот — суточные гены «на местах» помогают мозгу держать ритм. Об этом, в частности, свидетельствуют результаты исследователей из Медицинской школы Морхауз (США). Они обнаружили, что суточный ген Bmal1, работая в мышцах, регулируетцикл сна-бодрствования и что если его в мышцах отключить, то мозгу будет сложнее справляться с недосыпом.

Однако те белые пятна, что остаются в системе биологических часов, не отменяют очевидного факта: Холл, Росбаш и Янг раскрыли глубинную суть одного из самых фундаментальных процессов, свойственных земной жизни, а растущее день ото дня число статей на тему суточных ритмов говорит о том, что нынешние лауреаты сделали очень много для развития хронобиологии как отдельного научного направления.