Идеально: проверить всех на антитела

5 May

Кандидат медицинских наук Любовь Ивановна Станкевич уже месяц работает в Hadassah Medical Moscow. Участвует в создании новой лаборатории. Более 25 лет занимается лабораторной диагностикой. Из них почти 20 руководит лабораториями. Имеет богатый опыт работы в государственной, госпитальной и частной медицине. Работала в России и за рубежом. Вице-президент российской ассоциации лабораторной медицинской диагностики. 

Идеально: проверить всех на антитела

Любовь Ивановна, что представляет собой лаборатория Hadassah Medical Moscow на данный момент?

Это интересный проект. Лаборатория обслуживает нужды клинико-диагностического отделения. Ввиду ситуации с пандемией коронавируса передо мной была поставлена задача – наладить тестирование и предложить не просто различные варианты тестов, но и нестандартные, креативные решения. Выбрать из них наилучшие.  

О каких возможностях мы говорим?

Первая – это прямой поиск патогена. Мы пытаемся найти в биологическом материале вирус. Либо доказать, что пациент инфицирован. Либо доказать обратное. Для этого используются молекулярно-генетические методы. Чаще всего – это стандартный ПЦР. Мы сначала синтезируем ДНК из РНК. Восстанавливаем ДНК, а затем амплифицируем её. Проводим ПЦР-реакцию.

А можно для непосвящённых объяснить, что такое ПЦР-реакция, и как при помощи неё выявить коронавирус? Когда речь идет о КТ, обывателям более-менее понятно: на томографии виден рисунок коронавируса. Как это выделить при помощи анализа крови на антитела – тоже. Понятно, в чём заключается суть анализа с помощью тупфера. Как выявить заболевание при помощи ПЦР?

ПЦР – это полимеразная цепная реакция (английская аббревиатура – PCR). Мы ищем вирус SARS-Cov-2 по характерным участкам генома, которые можем найти в биологическом материале. Берём мазок из горла. Там у нас содержатся клетки человека, слизь, другая бактериальная флора. У нас стоит вопрос: есть там вирус или нет? Для ответа на вопрос мы сначала используем молекулы мишеней, которые могут найти во всей биомассе специфические участки генома. То есть, такие последовательности нуклеотидов, которые характерны только для вируса SARS-Cov-2. Который вызывает заболевание COVID-19.

Если мы находим суть этой цепной реакции, мы запускаем реакцию, которая начинает многократно воспроизводить найденные нами участки генома. Если мы нашли один фрагмент, на выходе сделали из него тысячи, тысячи, тысячи. Это позволяет нам, даже найдя в низкой концентрации фрагментов генома вируса, в итоге получить хороший сигнал, который мы можем детектировать с помощью коэффициентных красителей. Конечный итог реакции – это развитие флюоресцентного сигнала, который мы можем оптическими методами обнаружить. 

Это типа теста с использованием лакмусовой бумажки?

Лакмусовая бумажка – это колориметрия. Это изменения цвета. А у нас – флюоресценция. Это детекция флюоресцентного сигнала: мы добавляем флюоресцентные красители, которые связываются с продуктами нашей реакции. То есть, если мы нашли участки фрагмента, провели реакцию, чтобы из единичных стало огромное множество, и запустили молекулы, которые в случае получения таргетного продукта – много раз воспроизведённый специфический участок генома вируса – у нас связывается флюоресцентная метка, и мы можем поймать оптико-флюоресцентный сигнал. И, соответственно, измерить его. 

Получается своего рода маркер?

Да. У этой реакции есть различные модификации. Можно совмещать его с гидролизацией: сначала мы проводим реакцию, а потом не увеличиваем во много раз количество искомых мишеней, а, наоборот, уже начинаем продукт реакции, чтобы привести его к детекции, много раз амплифицировать. 

Существуют и другие модификации?

Суть их сводится к одному: по элементам генома вируса мы пытаемся найти (с помощью различных техник) специфические участки генома вируса и сделать вывод – что в данном биоматериале вирус есть. Метод этот родился не для коронавируса. Уже десятки лет применяется для самых различных инфекций: бактерий, грибов, вирусов. Мы им пользуемся широко и очень давно. Поэтому, когда стала задача дектектировать в биологическом материале коронавирус, естественно это был метод №1, который выбрали все. С ним начали работать и азиатские коллеги, которые первыми столкнулись с эпидемией, и американцы, и европейцы, и мы в Российской Федерации, в Израиле – все работают этим методом. 

Каково преимущество этого метода по сравнению с другими?

Неоспоримое преимущество: получив результат, с большой долей вероятности можем утверждать, что пациент инфицирован коронавирусом – SARS-Cov-2. Именно этим типом вируса. 

Это 100% или не 100%? Есть всё-таки ложноположительные реакции…

Всем хочется сказать: если результат отрицательный, значит пациент не инфицирован. И вот здесь делают большую ошибку. Потому что отрицательный результат, полученный методом ПЦР, к сожалению, не исключает наличия вируса у пациента.

Насколько точным является результат? По-моему, в России говорили, что это около 70%.

В процентах сказать сложно. Есть упоминания в научной литературе – от 40% до 70%. Объясню, почему. Всё зависит от того, с каким контингентом мы работаем. Есть несколько причин, почему отрицательный результат не исключает наличие вируса. Мы говорим «не обнаружен», а на самом деле не можем исключить наличие вируса. Первая причина: если мы применяем этот метод (а он действительно хороший) для биоматериала, в котором микроорганизм не живёт в данный момент, то наши усилия становятся бесполезными. И как раз эти большие проценты – 60%, 70% - они и распространяются на этот случай. 

В чём причина? 

Мы массово ищем вирус в основном с помощью мазков из ротоглотки. Чуть получше – из носоглотки. Еще лучше – из мокрот. Лучше этого – смывы из нижних дыхательных путей.  Массово, в подавляющем большинстве случаев, берут мазки из ротоглотки. 

Но вирус не живет в ротоглотке. Он использует слизистую верхних дыхательных путей очень короткое время, чтобы зайти извне, закрепиться и начать спускаться туда, где у него мишень поражения, мишень его интересов. А это не эпителий ротоглотки. Получается, что в 90% случаях из лабораторных тестов, это мазки из ротоглотки. А вирус там не живёт. Он там бывает краткий промежуток времени. И когда мы в массовом порядке получаем этот результат, 70%, мы говорим о пациентах с пневмонией, с клиникой. Врачи говорят: «Мы диагностируем по клиническим симптомам». «У нас диагноз по картине КТ. Мы практически уверены, что это картина коронавируса». А если мы используем для анализа мазок из горла – он показывает отрицательный результат. 

Потому что вирус уже давно не в горле?

Он уже ниже. Именно поэтому все последние медицинские публикации рекомендуют брать биоматериал из нижних дыхательных путей: мокроты – если пациент легкой-средней тяжести, если он кашляет и выделят мокроты. В таком случае нужно не мазки смотреть, а мокроты. Там больше вероятность найти вирус. Но ищут «под фонарём»

Если же это уже тяжёлый пациент, то в идеале мы выполняем бронхоальвеолярный лаваж. Но когда пациент уже попадает на ИВЛ, технически становится не так-то просто получить этот материал. 

А другая причина?

На основании самых последних данных, у всех людей в мире на слуху, что COVID-19 – болезнь, вызванная вирусом SARS-Cov-2 – это пневмония. На самом деле может оказаться, что это не совсем так. Как минимум сейчас уже накоплено достаточно данных, что вирус поражает не только лёгкие. И может быть даже не столько лёгкие. У вируса обнаружены участки генома, которые кодируют белки, которые способны связываться с гемом и предшественниками гена и нарушать функцию гемоглобина в эритроцитах крови. Это приводит к блокировке дыхательных функций молекулы гема с клетки эритроцита и в общем всей кровеносной системы. Так как лёгкие являются органом, который обеспечивает нас кислородом, то и реакция в лёгких наиболее заметна. 

По поводу картины развивающейся пневмонии уже есть мнения исследователей?

Уже накоплено определенное количество этих мнений, есть публикации о том, что картина, которую видят на КТ – это ответ на гипоксию, устроенную вирусом, потому что он блокирует функционирование белка гема. Это подтолкнуло исследователей изучать различные биоматериалы. Исследователи считают, что мы можем не находить вирус в материале верхних дыхательных путей. Но мы можем находить его в крови. Создаётся такое впечатление, что, чем ближе состояние пациента к тяжёлым и терминальным стадиям, тем с большей вероятностью мы найдём вирус именно в крови. 

То есть, ко всем уже озвученным вариантам тестирования следует добавить анализ крови.

Мы должны научиться выделять вирус из крови. Пока ещё используют его выделение из клеток эпителия. Тем не менее эта техника возможна. 

Но она ещё не является общепринятой. Не стала стандартом?

Когда мы имеем тяжелых пациентов, и нам нужен прогноз на уход пациента в неуправляемую терминальную стадию, у этих пациентов, наверное, оправдано тестировать кровь. Вирус стремится попасть в кровь. 

Уже опубликованы данные о том, что вирус имеет склонность поражать желудочно-кишечный тракт. Кишечная форма вируса тоже существует?

У самого первого описанного пациента в США была совершенно нетипичная для коронавируса картина: его госпитализации предшествовала рвота. То есть, картина пищевой токсикоинфекции – тошнота и рвота, потом развилась диарея. Затем, в тяжёлом состоянии, он был госпитализирован, и в итоге у него был обнаружен коронавирус. Данные многих исследователей говорят о том, что кишечная форма вируса тоже существует.  

Это как-то связано с состоянием иммунной системы? С ослабленным иммунитетом?

С иммунной системой человека связано всё. Вирус обладает белками, механизм патогенности которых реализуется не только через лёгкие, но и через молекулы и эпителии желудочно-кишечного тракта. Это свойство вируса заходить в клетки этих органов и вызывать поражение. 

То есть такой процент неуспеха – ложноотрицательных результатов – не из-за методики. А потому, что вирус пытаются поймать там, где его в принципе в данный момент нет. А искать его нужно в эпителии нижних дыхательных путей и кишечнике? А если вирус находится в кишечнике, это означает, что, в принципе, он должен быть и в кале?

В диарейных массах. Есть публикации об этом. Даже исследовались анальные мазки пациентов. Я даже встречала тексты, что у отдельных групп пациентов в анальных мазках вирус обнаруживался чаще, дольше и в большей концентрации, чем в мазках верхних дыхательных путей – мазках и горла. Но это как раз те пациенты, у которых пошёл сценарий поражения желудочно-кишечного тракта. 

Если верить тому, что Вы говорите, то вирусом может заразить человек, который просто испортит воздух, выпустив газы. 

Концентрации не хватит. У нас всё-таки подобие многослойной маски есть – на нас одежда. А то, что сейчас уже говорят про фекально-оральный путь, это факт. Если после туалета не вымыты руки, которые потом оставят где-то на поверхности следы, это может привести к распространению вируса. Если вначале устойчиво и уверенно говорили о распространении вируса воздушно-капельным путём, сейчас всё больше мнений в литературе, что он распространяется и фекально-оральным.  

Hadassah Medical Moscow запустила тесты на антитела. У Вас прибавится работы?

Всё, что мы говорили про ПЦР – это прямой метод. Мы поймали и вирус, и говорим: вот он. Либо не поймали. Но в лабораторной диагностике, в медицине тоже испокон веков используется косвенный метод суждения об инфицировании пациента. 

Что такое – косвенный метод? 

Это и есть поиск антител. Здесь в качестве первой скрипки, выступает универсальный механизм выживания – способность иммунной системы находить чужеродные белки, атаковать, убивать их и защищать организм. Коронавирус – не исключение. Как только он попадает в организм, он должен у нормального здорового человека вызывать иммунный ответ. На этом базируется косвенная лабораторная диагностика. Мы не ищем напрямую патоген, но по характеру иммунного ответа, по его наличию или отсутствию, по спектру антител, именно по характеру – какие антитела вырабатываются, мы можем предоставить очень много информации. В некоторых случаях эта информация становится более интересной, более важной и более точной, чем прямой поиск патогенов. Поэтому вторая волна тестов на коронавирус – это тесты на антитела. 

Какие бывают антитела?

Вообще их бывает 5 классов. Есть подклассы. Чаще всего ведущую скрипку имеют два вида антител: это антитела класса IgG и IgM. Для инфекций, которые проникают в организм через слизистые оболочки, что верно и для коронавируса, ещё играют роль антитела класса IgA. Потому что это антитела, которые вырабатывают именно слизистые.

Что такое антитела класса IgM?

Это антитела первой линии обороны. Это первый, самый быстрый антительный ответ организма. В организме, который никогда не встречался с этим патогеном – в данном случае с коронавирусом – мы не обнаружим ни IgG, ни IgA, ни IgM. И мы можем утверждать, что такой пациент не заражался никогда ранее и предположить, что он не заражён в данный момент. Почему тоже «предположить»? Потому что всегда надо помнить, что для выработки антител, для их появления после момента встречи с патогеном, то есть, когда он зашёл в организм, должно пройти от 3 до 7 дней до появления IgM и в среднем 14 дней до появления IgG. То есть, когда мы не обнаружили никаких антител, но мы подозреваем, что пациент может быть заражён (например, он живёт в одной квартире с заражённым, который точно находится на домашнем лечении), мы его тестируем и всё-таки сомневаемся – может быть он только что заразился.

Как решается эта проблема?

Мы проводим повторное тестирование через 5-7 дней. Если антитела не появились, значит мы можем с гораздо большей достоверностью утверждать, что пациент никогда не встречался с патогеном и в данный момент не заражён.

Если мы обнаруживаем антитела IgM и при этом не обнаруживаем антитела IgG, мы можем утверждать, что наш пациент совсем недавно познакомился с этим новым патогеном – в данном случае с вирусом SARS-Cov-2. Мы ожидаем, что, если мы видим картину IgM + IgG – (минус), мы находимся в первых двух неделях от момента встречи с вирусом до момента тестирования. То есть, прошло менее 14 дней, но, скорее всего, больше 7. То есть, мы с достоверностью 7 дней можем приблизительно понимать, когда произошло инфицирование. В этом случае тоже полезно повторное тестирование через 5-7 дней потому, что, если наша картина начинает меняться – антител IgG не было неделю назад, а через неделю при повторном тестировании они появились – этот феномен называется сероконверсия. То есть, антител не было, а теперь они появились.

Выявление такой сероконверсии является практически 100 процентным доказательством того, что пациент инфицирован, и у него развивается инфицирование. Это не значит, что он заболеет и войдёт в пневмонию и т.д. Но то, что он точно встретился с коронавирусом, и вирус проник в его организм – это практически доказано. 

А что мы имеем, когда обнаруживаем только IgG и не обнаруживаем IgM?

Это, скорее всего, нам говорит о том, что от момента заражения прошло больше месяца. Либо больше. Годы. То есть и здесь это не является сразу констатацией факта болезни. Человек, который перенес – либо он болел, либо он не болел (про это тоже очень много говорят, это отдельная тема для обсуждения, что скрытые носители составляют огромную массу населения, и такие люди не заболели – у них были либо незначительные симптомы, либо вообще их не было, и мы только по наличию у них IgG-антител можем судить о том, что когда-то они с этим вирусом встретились и, в зависимости от анамнеза либо болели, либо не болели). Это краткая подоплёка характера антител, почему мы можем их использовать и почему можем получить так много информации, когда тестируем отдельно IgM-антитела и отдельно IgG-антитела. 

А что насчёт IgA-антител?

В начале я обмолвилась, что это антитела слизистых – их вырабатывают слизистые. Здесь они играют роль, потому что вирус заходит через слизистые оболочки, и они являются в своем роде аналогом IgM-антител. Они тоже являются первой линией обороны.

То есть, IgA интерпретируются приблизительно так же, как IgM. Поэтому, суммируя свойства этих антител, обладая знаниями динамики их появления в организме и сопоставляя результаты по разным классам и ещё если их динамики с интервалом 5-7 дней, мы можем иметь гораздо больше информации, чем при попытке поиска прямого патогена.

Мы можем выявлять и сортировать пациентов: тех, кто в острой стадии инфекции, и тех, кто уже перенес инфекцию. Эту информацию мы сопоставляем с эпиданамнезом и с клиникой – есть симптомы, нет симптомов. Болеет ли уже пациент. В какой он стадии. Это очень полезная информация.

Мы можем исключить пациентов, у которых могут быть подозрения. То, что я рассказывала: пациент был в подозрительной зоне – заразился он или нет? Проверяем антитела, через 5 дней повторяем и можем практически достоверно снимать подозрения. Но в условиях эпидемии такой человек рассматривается так же, как пациент риска. То есть, он не защищён.

Мы можем отсортировать, найти тех, кто является скрытым носителем. Если пациент заявляет: «Я не болею, признаков никаких нет. Дайте мне пропуск – хочу ходить, где хочу по Москве», мы его тестируем и видим, что у него есть IgM-антитела или IgM+IgG-антитела, такого пациента нужно рассматривать как потенциально опасного. Этот пациент в ближайшее время находится от момента встречи с патогеном и потенциально он ещё может находиться у него где-то в верхних дыхательных путях. Потенциально такой человек может рассматриваться как опасный в плане распространения эпидемии. 

В каких еще случаях тест может быть полезен?

В клинике, куда поступают пациенты уже с развернутой клинической картиной. Тест сейчас доступен в Hadassah Medical Moscow в экспресс-формате. Проблему представляют пациенты с пневмонией, которых мы госпитализируем. Врачу нужно как можно быстрее понимать, чтобы правильно маршрутизировать с эпидемиологической точки зрения – пациент инфицирован или не инфицирован. У него берут мазок из горла, но результаты не приходят день в день. Практика показывает, что когда идёт наплыв, когда идут уже пиковые значения пациентов, уже негде хоронить умерших – это тестирование волной останавливает потоки. Ждут до 7 дней результатов. 

Что такое 7 дней для врача, когда ему нужно определиться с терапией?

Врачу нужно очень быстро знать – как лечить пациента: с помощью противовирусной терапии или дать ему антибиотики от обычной пневмонии. Как отличить? Ответ врачу нужен прямо в приёмном отделении. Пока пациент ещё не маршрутизирован в клинике, и он ждёт назначения терапевта. Здесь ПЦР не может помочь, потому что метод сложный. Он недоступен в экспресс-формате. А антитела – доступны. 

И можно очень хорошо помочь решению этой клинической задачи посредством теста на антитела.

Естественно, выявляем антитела, обязательно – мазок. Ждем подтверждения, что мы нашли вирус в верхних дыхательных путях. Если у нас отрицательные антитела, а клиника уже разворачивается, то этих пациентов можно вести немного по-другому. С эпидемиологической задачей ПЦР вообще не справится. Мы не можем тотально всех людей обследовать методом ПЦР, брать у них мазки. Здесь мы идем на группы риска – либо контактные люди, либо уже сами пациенты с симптоматикой. А антитела ввиду своей дешевизны и простоты – экспресс-тесты – могут использоваться для тотального скринирования пациентов, чтобы очень быстро делать эпидемиологические карты распространения. Понимать, где у нас чистый регион, менее контактирующий с вирусом, где у нас пациенты с высоким уровнем антител. Это инструмент в руки для управления карантинными мероприятиями. 

Чтобы ответить на вопрос в какой-то конгломерации: можно уже снимать карантин или нет? 

Идеально – всех тотально проверить на антитела. И мы поймём: у нас столько-то процентов с симптоматикой лежат в госпитале больных, столько-то ПЦР-положительных, а вот остальная масса – 80%, если мы среди них понимаем, что больше половины имеют IgG, скрытые люди – с антителами, это одна эпидемиологическая картина. Если же у нас люди в большинстве своём вообще не имеющие антитела, а количество госпитализированных и кривая нарастания большая, такая конгломерация не защищена и подлежит строгому карантину. 

Это ключ, инструмент для более эффективного управления карантинными мероприятиями?

Тест на антитела – хороший помощник как в клинике, так и для эпидемиологов. Для тех, кто здоров или якобы здоров, но скрытый носитель. Эта проверка может сильно улучшить ситуацию. Вот почему было принято решение помимо ПЦР-тестирования – то, что сейчас является в России стандартом – усилить лабораторную диагностику на вирус SARS-Cov-2 тестированием на антитела. И в формате экспресс-тестов, и в формате ИФА-анализа (иммуноферментного анализа). Сейчас мы готовимся делать и IgG, IgMи IgA. Всё это делать отдельно и в экспресс-тестах, и в формате, который может давать полуколичественную оценку титра антител, чтобы иметь как можно больше и давать нашим заказчикам как можно больше информации для управления этой эпидемией.

Насколько эффективен метод термометрии?

У нас в Hadassah Medical Moscow был случай, когда пришёл доктор. У него было 37.1. Ему вызывали «скорую». Врач 14 дней находился в «Коммунарке». У него взяли мазок и сказали, что ждут результат. Результат пришёл через 7 дней. Это та проблема, о которой я говорила: он 7 дней ждал свой отрицательный результат. Когда он его дождался и сказал: «Выпустите меня отсюда», ему сказали: «По протоколу, прежде чем Вас выпустить, мы должны получить двойной отрицательный результат. Поэтому мы опять берём у Вас мазок». Он ждал ещё неделю до второго отрицательного результата.

Получается, что мы здорового врача-специалиста вывели из рабочего поля, в условиях, когда не хватает специалистов. Отвезли в место, где концентрация вероятности заразиться сильно выше. Туда, куда стекаются реально больные.


Иммунные системы у всех разные. Мы все встречаем вирус по-разному. Почему есть скрытые носители и скрыто переболевшие? 

Есть люди, у которых иммунная система справилась быстро. В силу разных причин. А есть люди, у которых иммунная система встретила вирус не так быстро. И волнообразное течение это тоже может отражать. Вот у нас IgM выработались, они уже пошли на снижение, а IgG ещё в большом количестве не наработались. И у нас может начаться вторая волна. 

Есть публикации, что плазма от переболевших имеет терапевтический эффект. 

Её переливают людям в терминальных стадиях и добиваются улучшения. Мы можем помочь тем, кто не может сам выработать антитела, взяв их у тех, кто хорошо их вырабатывает. И здесь метод ИФА – это единственный, просто золотой ключик, который позволит найти кандидата даже в семье. Очень много историй про Италию, где одновременно заразились отец и сын. Отец умер, сын выжил. Или муж и жена.

Естественно, есть кто-то, кто переболел и выздоровел, и хочет помочь члену семьи или другу, кому-то из сообщества, кто не может сам справиться с инфекцией – это способ подтвердить, что это сыворотка с высоким содержанием IgG-антител. И этот человек действительно может помочь больному. У него можно брать плазму.

Если бы у человечества хватило денег и ресурсов, если бы мы могли тотально скринировать всё человечество на антитела в любой момент времени – сегодня, завтра – мы бы справились с этой ситуацией намного лучше и быстрее. У нас было бы больше шансов. Это и моё мнение и мнение других иммунологов.